D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
O fungo fitopatogênico Colletotrichum coccodes causa doenças perigosas em batatas e tomates, conhecidas como antracnose e mancha preta nos tubérculos. Por características morfológicas, muitas vezes são difíceis de distinguir de doenças causadas por outros microrganismos; nos frutos verdes do tomate, a doença pode ser assintomática, manifestando-se apenas nos frutos vermelhos maduros. Para um diagnóstico rápido e preciso do patógeno, é oferecido um sistema de teste de PCR em tempo real. Para desenvolver um sistema de teste, a sequência de nucleotídeos do gene glicerol trifosfato desidrogenase de cepas de 45 C. coccodes isoladas de tubérculos de batata em diferentes regiões da Rússia foi determinada.
Com base nos resultados obtidos e na análise de sequências semelhantes de outras espécies disponíveis na base de dados do GenBank, foram desenhados primers específicos para espécies e sonda para C. coccodes. Para verificar a especificidade do sistema teste criado, a PCR foi realizada com DNA isolado de culturas puras de 15 diferentes espécies de fungos parasitas e saprotróficos associados a tomate e batata (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). A presença de DNA de coccodes de Colletotrichum foi determinada em um ciclo limite de 20-27, enquanto outras espécies foram detectadas após 40 ciclos ou não foram detectadas. O sistema de teste possibilita a detecção confiável de concentrações de DNA de C. coccodes superiores a 0.01 ng / mm3 na mistura de PCR analisada. Utilizando o sistema de teste desenvolvido, foi investigada a presença de C. coccodes em folhas de tomate com sintomas de doenças fúngicas e em tubérculos de batata sem sintomas externos da doença. Folhas com sintomas de infecção fúngica foram coletadas de dois campos diferentes no Território de Krasnodar, tubérculos - de campos nas regiões de Kostroma, Moscou, Kaluga, Nizhny Novgorod. Uma folha de tomate contendo DNA de C. coccodes foi encontrada no Território de Krasnodar; uma presença significativa de DNA desse patógeno foi detectada em 5 amostras de tubérculos cultivados nas regiões de Kostroma, Moscou, Kaluga.
Introdução
Os cogumelos do gênero Colletotrichum são fitopatógenos perigosos que afetam cereais, vegetais, ervas, frutas perenes e plantas de bagas. Uma das espécies onipresentes desse gênero, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes é o agente causador da antracnose e da mancha preta da batata e do tomate, e causa doenças de várias outras plantas da família Solanaceae, incl. ervas daninhas (Dillard, 1992). C. coccodes infecta todas as partes subterrâneas da planta, bases do caule, folhas e frutos (Andrivon et al., 1998; Johnson, 1994). Na casca dos tubérculos de batata infectados, observa-se o desenvolvimento de manchas cinza com bordas indistintamente pronunciadas, nas quais manchas pretas de esporulação e microescleródios são claramente visíveis. Durante o armazenamento, úlceras com conteúdo amolecido podem se formar na polpa dos tubérculos, ou seja, a doença entra na fase de antracnose, que, no entanto, é extremamente rara.
Ao mesmo tempo, os sintomas da antracnose (úlceras na pele com pequenos pontos pretos) são típicos do tomate. Nas folhas, os sintomas de C. coccodes aparecem como manchas marrom-escuras, geralmente contornadas por tecido amarelo (Johnson, 1994).
O desenvolvimento de manchas pretas nos tubérculos prejudica a sua aparência, que é especialmente pronunciada na venda de batatas de casca vermelha lavadas. A esfoliação da casca leva à evaporação excessiva e aumento das perdas de armazenamento (Hunger e McIntyre, 1979). Danos a outros órgãos da planta levam a perdas de produção, que foram observadas tanto em terreno aberto quanto fechado (Johnson, 1994; Tsror et al., 1999). Doenças causadas por C. coccodes são comuns em quase todas as regiões produtoras de batata do mundo, incluindo a Rússia (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). O controle dessas doenças é difícil devido à eficácia insuficiente dos fungicidas existentes contra C. coccodes e à falta de variedades resistentes (Read, Hide, 1995).
O inóculo de C. coccodes pode persistir em tubérculos de sementes (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), sementes de tomate (Ben-Daniel et al., 2010), sobreviver por muito tempo no solo, em restos de plantas (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) e em ervas daninhas (Raid, Pennypacker, 1987). Os trabalhos de uma série de autores (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) mostraram que o desenvolvimento da doença em batatas e tomates depende em grande parte da presença de inóculo nas sementes e solo. Portanto, para minimizar as perdas da doença, é necessário diagnosticar (inclusive quantitativamente) propágulos fúngicos no material da semente, no solo, nos tubérculos de batata-semente e sementes de tomate colocadas para armazenamento. O diagnóstico morfológico em solo e material vegetal pode ser realizado apenas pela presença de microescleródios, que, entretanto, também são encontrados em outros tipos de fungos.
Os sintomas nos tubérculos são muito semelhantes aos da crosta prateada causada pelo fungo Helminthosporium solani. O isolamento de coccódigos de Colletotrichum e Helminthosporium solani em uma cultura pura é bastante difícil e leva muito tempo devido ao crescimento lento em um meio nutriente. Para identificar rapidamente os coccódigos de Colletotrichum, é necessário o uso de métodos de diagnóstico instrumentais. O método mais conveniente é a reação em cadeia da polimerase (PCR) e sua modificação - PCR em tempo real. Atualmente, um sistema de teste desenvolvido por pesquisadores britânicos (Cullen et al., 2002) para a região ITS1 do rDNA é usado na Europa e nos Estados Unidos. Seu uso tem mostrado bons resultados na análise de isolados russos (Belov et al, 2018). No entanto, C. coccodes é altamente variável e sua detecção a partir de uma sequência de DNA pode levar a resultados falsos negativos. Para um diagnóstico mais confiável, a análise é necessária para várias sequências de DNA específicas da espécie e, portanto, desenvolvemos um sistema de teste original que permite identificar C. coccodes pela sequência do gene gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase.
materiais e métodos
Para avaliar a eficácia e especificidade dos sistemas de teste criados, foram utilizadas culturas puras de 15 espécies de fungos isolados pelos autores de amostras doentes de folhas e frutos de tomate, tubérculos de batata (Tabela 1). Para o isolamento, foram retirados os órgãos das plantas com sintomas de infecção fúngica, no máximo um órgão por arbusto.
Uma fatia de um tubérculo com casca, uma fatia de tomate e uma folha afetada foram colocadas sob um microscópio binocular, após o qual micélio, esporos ou um pedaço de tecido foram transferidos para um meio de ágar (ágar mosto) em uma placa de Petri com uma agulha de dissecação afiada. Os isolados foram armazenados em ágar inclinado em tubos de ensaio a 4 ° C.
Amostras de folhas de tomate com sintomas de doenças fúngicas, destinadas à análise, imediatamente após a coleta (no campo) foram colocadas em álcool etílico 70%, onde foram armazenadas até o isolamento do DNA. Os tubérculos de batata foram entregues ao laboratório, descascados (pedaço de 2 × 1 cm) deles e congelados a –20 ° С. Armazenado congelado até o isolamento do DNA.
Culturas puras de fungos para isolamento de DNA foram cultivadas em meio líquido de ervilha. O micélio do fungo foi removido do meio líquido, seco em papel de filtro, congelado em nitrogênio líquido, homogeneizado, incubado em tampão CTAB, purificado com clorofórmio, precipitado com uma mistura de isopropanol e acetato de potássio 0.5 M, lavado duas vezes com álcool 2%. O DNA resultante foi dissolvido em água desionizada e armazenado a –70 ° С (Kutuzova et al., 20). A concentração de DNA foi medida usando um kit de quantificação de DNA de HS para DNA de fita dupla no Qubit 2017 (Qiagen, Alemanha). As amostras alcoolizadas e congeladas foram trituradas em nitrogênio líquido, em seguida a extração do DNA foi realizada conforme descrito acima (para o micélio de culturas puras de fungos).
Tabela 1. Origem das cepas de fungos usados
Nome do cogumelo | Planta, órgão | Lugar de seleção |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | tubérculo de batata | Região de Kostroma, tubérculos de batata da 1ª geração do campo, cultivar Red Scarlett |
Cocódigos de Colletotrichum 4 | folha de batata | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminhosporium solani | tubérculo de batata | Região de Magadan, pos. Tenda, tubérculo de batata |
Cladosporium fulvum | folha de tomate | Região de Moscou, tomate de frutos grandes |
Alternaria tomatefila | tomate fruta | apresentado pela equipe do laboratório de micologia e fitopatologia do All-Russian Research Institute of Plant Protection |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | tomate fruta | Território de Krasnodar, distrito de Krymsky, grau Cream |
Fusarium oxysporum | raiz de trigo | Região de Moscou. |
O PCR foi realizado em um amplificador DTprime (DNA-Technology). Para a PCR, foram usados primers originais e uma sonda para a região espécie-específica do gene da glicerol trifosfato desidrogenase: primer forward Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, primer reverso Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1). Os primers amplificam uma região de 213 pb.
A reação levou 50 ng de DNA total (na análise de folhas e tubérculos) e 10 ng (na análise de DNA de culturas puras de fungos). A mistura de reação (35 μl) foi separada por uma camada de parafina em duas partes: a inferior (20 μl) continha 2 μl de tampão de reação 10 × (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM de cada trifosfato de desoxinucleotídeo, 7 pmol de cada iniciador e 4 pmol de uma sonda fluorescente hidrolisável; o superior continha 1 μl de tampão de PCR 10 × e 1 U de polimerase Taq.
A separação da mistura com parafina permite que os tubos sejam armazenados por um longo tempo a uma temperatura de 5 ° C e forneça um início quente para PCR após aquecê-los por 10 min a uma temperatura acima de 80 ° C A PCR foi realizada de acordo com o seguinte programa: 94.0 ° C - 90 s (1 ciclo); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciclos); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciclos); 10.0 ° C - armazenamento.
Resultados e discussão
As sequências do gene da glicerol trifosfato desidrogenase foram determinadas em 45 cepas isoladas de folhas, caules, tubérculos de batata e frutos de tomate (Kutuzova, 2018) em diferentes regiões da Rússia. As sequências investigadas de todas as cepas foram divididas em 2 grupos diferindo em dois nucleotídeos. As sequências de nucleotídeos dos representantes de ambos os grupos sob os números KY496634 e KY496635 estão depositadas no GenBank.
Os primers coc70gdf, coc280gdr e a sonda cocgdz projetados em sua base foram verificados usando o programa BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) em todas as sequências do gene glicerol trifosfato desidrogenase de espécies do gênero Colletotrichum e outros organismos disponíveis no banco de dados do GenBank.
Nenhuma região de DNA de outros organismos altamente homólogos aos iniciadores e à sonda foi encontrada.
A sensibilidade do sistema de teste foi verificada usando amostras com diferentes concentrações de DNA de C. coccodes, DNA de folha de batata infectada com antracnose (coletada em 2017 em Mari El, variedade Red Scarlett) e casca de tubérculos afetados por mancha preta (coletada na região de Kostroma, variedade Red Scarlett, Tabela 2). Para confirmar a presença de DNA em tubérculos e folhas de batata, cepas de C. coccodes foram isoladas deles em culturas puras.
Os resultados da análise de sensibilidade do sistema de teste mostram que ele pode ser usado para diagnosticar com sucesso a presença de C. coccodes DNA em uma amostra quando o seu conteúdo total na mistura de PCR é superior a 0.05 ng. Isso é suficiente para a detecção, uma vez que um esclerócio contém, em média, 0.131 ng, e um esporo contém cerca de 0.04 ng de DNA (Cullen et al., 2002). O sistema de teste desenvolvido pelo grupo britânico (Cullen et al., 2002) mostrou sensibilidade semelhante (ciclo limite 34 a 0.05 ng de DNA e 37 a 0.005 ng).
A análise de amostras naturais contendo C. coccodes em todos os casos permitiu revelar com segurança a sua presença na amostra (Tabela 2). O método proposto para isolamento de DNA também foi aplicável para a análise de amostras naturais de plantas.
Tabela 2. Determinação da sensibilidade do sistema de teste proposto para a identificação de coccódigos de Colletotrichum para PCR em tempo real
amostra | Quantidade de DNA na amostra *, ng | Ciclo de limiar | Detecção de C. coccodes |
---|---|---|---|
Cocos de Mycelium Colletotrichum | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Casca de tubérculo 1 | 50 | 32 | + |
Casca de tubérculo 2 | 50 | 30 | + |
Casca de tubérculo 3 | 50 | 31.5 | + |
Folha de batata | 50 | 29.5 | + |
Nota. * Em uma mistura de produtos de PCR.
A especificidade do sistema de teste foi testada em amostras de DNA extraídas de 15 espécies de fungos. Todas as cepas de fungos foram isoladas pelos autores de frutos e folhas de tomate saudáveis e afetados, tubérculos de batata; uma cepa foi isolada da raiz do trigo (Tabela 1). Entre aqueles isolados da superfície do fruto, existem espécies que não são patogênicas para o tomate (por exemplo, Phellinus ferrugineovelutinus).
Estudos mostraram que o DNA de C. coccodes foi detectado em um ciclo limite de 20-27, enquanto outras espécies de fungos não foram detectadas ou deram um sinal após o ciclo 40, o que pode ser atribuído a um efeito de ruído não específico (Tabela 3).
Tabela 3. Verificando o sistema de teste para vários tipos de cogumelos
Nome do cogumelo | Ciclo de limiar |
Cocos de Colletotrichum 1 | 20.9 |
C. códigos 2 | 22.6 |
C. códigos 3 | 23 |
C. códigos 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A.tomatophila | > 40 |
Helminhosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilionectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Nota. * A quantidade de DNA em todas as amostras foi de 10 ng.
O sistema de teste desenvolvido foi usado para identificar C. coccodes em amostras de folhas de tomate com sintomas de patógenos necrotróficos e tubérculos de batata-semente sem sintomas visíveis. Para o estudo, coletamos tubérculos de sementes de diferentes variedades cultivadas nas regiões de Kostroma, Moscou, Kaluga, Nizhny Novgorod. A presença de DNA de C. coccodes foi considerada significativa nas amostras, em cuja análise o ciclo limite não excedeu 35. Este valor limite foi selecionado com base na determinação confiável de 0.05 ng de DNA de C. coccodes (ciclo limite 33.5, Tabela 2) e no fato de que em ciclos de limiar acima de 40, DNA não específico de algumas outras espécies de fungos foi diagnosticado. Com esta abordagem, uma presença significativa de DNA de C. coccodes foi detectada em 5 amostras de tubérculos cultivados nas regiões de Kostroma, Moscou, Kaluga e em uma folha de tomate do distrito de Yeisk da região de Krasnodar (Tabelas 4, 5).
Tabela 4. Detecção de coccódigos de Colletotrichum em tubérculos de batata *
Número da amostra | Variedade de batatas | Lugar de crescimento | Detecção de C. coccodes | Ciclo de limiar |
---|---|---|---|---|
1 | Vermelho escarlate | Região de Kostroma | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Região de Moscou. | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky cedo | Região de Moscou. | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Região de Kaluga | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantasia | Região de Kaluga | - | |
15 | Gala | região de Nizhny Novgorod. | - | |
16 | - |
Nota. * A quantidade de DNA em todas as amostras foi de 50 ng.
Tabela 5. Detecção de coccódigos de Colletotrichum em folhas de tomate *
Número da amostra | Lugar de crescimento | Detecção de C. coccodes | Ciclo de limiar |
---|---|---|---|
1 | Território Krasnodar, Distrito da Crimeia | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Território de Krasnodar, distrito de Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* A quantidade de DNA em todas as amostras foi de 50 ng.
O sistema de teste por nós criado não é inferior ao desenvolvido por pesquisadores britânicos (Cullen et al., 2002) em sensibilidade e especificidade e é adequado para a análise de amostras de plantas. A sua aplicação para análise de tubérculos de sementes permitiu identificar DNA de C. coccodes em tubérculos sem sinais externos de danos e analisar com sucesso a infecção de folhas.
Até o momento, nenhuma análise de tubérculos de batata para infestação de C. coccodes foi realizada na Rússia. Nosso primeiro estudo mostrou que de 16 tubérculos de semente testados cultivados em diferentes regiões da Federação Russa, 5 contêm C. coccodes. Isso mostra que a mancha preta dos tubérculos da batata é uma doença comum na Rússia e seu papel na redução do volume e da qualidade da cultura da batata é subestimado.
A análise de folhas de tomate revelou uma presença significativa de DNA de C. coccodes em uma folha do distrito de Yeisk do Território de Krasnodar. Anteriormente, ao examinar campos de tomate no sul da Rússia usando o sistema de teste britânico (Cullen et al., 2002), foram encontradas folhas contendo C. coccodes, e em alguns campos uma alta proporção de folhas infectadas com C. coccodes foi encontrada (Belov et al., 2018). Nos territórios de Krasnodar e Primorsky, na região de Moscou, encontramos frutos de tomate, dos quais conseguimos isolar culturas puras de C. coccodes. É possível que o C. coccodes seja muito mais difundido no tomate na Rússia do que se acredita atualmente, e sua nocividade também é subestimada.
Assim, até o momento, informações suficientes foram acumuladas sobre a ampla distribuição de C. coccodes em batatas e tomates.
Para entender melhor o papel desse fungo no desenvolvimento de doenças da batata e do tomate, é necessário monitorar sua prevalência na Rússia, estudar o papel das infecções do solo e das sementes e o papel da mancha preta nas perdas durante o armazenamento. O uso de diagnósticos de PCR pode facilitar significativamente esse trabalho, e o uso simultâneo de ambos os sistemas de teste aumentará significativamente a precisão da análise.
Este trabalho foi financiado por uma bolsa da Russian Science Foundation No. 18-76-00009.
O artigo foi publicado na revista "Mycology and Phytopathology" (volume 54, No. 1, 2020).