Características biológicas e resistência a fungicidas do fungo fitopatogênico Ilyonectria crassa

COMER. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Alexandrova, S.N. Elansky

Recentemente, foi demonstrado que o fungo ascomiceto Ilyonectria crassa é capaz de infectar tubérculos de batata. Este trabalho é o primeiro a analisar as características biológicas e a resistência a alguns fungicidas da cepa I. crassa isolada de batata. As sequências de regiões específicas da espécie da cepa “batata” coincidiram com aquelas obtidas anteriormente para fungos isolados de raízes de narciso, ginseng, choupo e faia, lírios e folhas de tulipa. Aparentemente, muitas plantas silvestres e de jardim podem ser reservas de I. crassa. A cepa investigada infectou fatias de tomate e batata, mas não infectou todo o fruto do tomate e tubérculo de batata intacto. Isso mostra que I. crassa é um parasita de feridas. A avaliação da resistência ao fludioxonil, difenoconazol e azoxistrobina em meio nutriente mostrou alta eficácia dessas drogas.

O índice EC50 (a concentração do fungicida, que diminui em 2 vezes a taxa de crescimento radial da colônia em relação ao controle fungicida) foi igual a 0.4; 7.4 e 4 mg / l, respectivamente. A possibilidade de desenvolvimento da doença causada por I. crassa deve ser levada em consideração na avaliação fitopatológica de tubérculos de batata e no desenvolvimento de medidas fitofarmacêuticas.

O desenvolvimento de microrganismos fitopatogênicos leva a grandes perdas em todos os estágios de cultivo e armazenamento da batata. No planejamento de medidas de proteção, via de regra, patógenos conhecidos são levados em consideração, como espécies dos gêneros Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora, etc. No entanto, nos últimos anos, mais e mais relatos surgiram sobre o surgimento de novos microorganismos fitopatogênicos em batatas. Sua biologia é pouco estudada, a eficácia dos fungicidas usados ​​na batata em relação a elas é desconhecida, métodos de diagnóstico não foram desenvolvidos. Com o desenvolvimento em massa, eles são capazes de causar danos significativos à cultura da batata. Um desses microrganismos é o fungo ascomiceto Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, descoberto pelos autores em tubérculos de batata (Chudinova et al., 2019).

Este trabalho apresenta os resultados da análise da cepa de I. crassa isolada de tubérculos de batata. Foram estudadas a morfologia das colônias e estruturas miceliais de I. crassa, sequências de nucleotídeos de regiões específicas do DNA, virulência para batatas e tomates e resistência a alguns fungicidas populares.

materiais e métodos

Usamos a cepa I. crassa 18KSuPT2 isolada em 2018 do tubérculo de batata infectado cultivado na região de Kostroma. O tubérculo apresentava um tipo de podridão seca com cavidade recoberta por micélio marrom-claro. Utilizando uma agulha de dissecação estéril, o micélio fúngico foi transferido para uma placa de Petri com meio de ágar (mosto de cerveja 10%, ágar 1.5%, penicilina 1000 U / ml). As placas foram incubadas no escuro a 24 ° C.

Um microscópio óptico Leica DM2500 com uma câmera digital ICC50 HD e um microscópio binocular Leica M80 com uma câmera digital IC80HD (Leica Microsystems, Alemanha) foram usados ​​para fotografar, avaliar o tamanho e a morfologia de esporos e órgãos de esporos.

Para isolar o DNA, o micélio fúngico foi cultivado em meio líquido de ervilha, depois congelado em nitrogênio líquido, homogeneizado, incubado em tampão CTAB, purificado com clorofórmio e lavado duas vezes com álcool 2%.

O método de extração de DNA é descrito em detalhes no artigo de Kutuzova et al. (2017).

Para determinar as espécies por métodos moleculares e comparar com outras cepas conhecidas de I. crassa, a PCR foi realizada com primers que permitiram a amplificação de regiões de DNA específicas da espécie: ITS1-5,8S-ITS2 (primers ITS5 / ITS4, White et al., 1990), regiões do gene b -tubulina (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) e fator de alongamento de tradução 1α (tef1α) (iniciadores EF1-728F / EF1-986R, Carbone e Kohn, 1999). Os amplicons do comprimento desejado foram extraídos do gel usando o kit Evrogen CleanUp. As regiões amplificadas foram sequenciadas usando o BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, CA, EUA) em um sequenciador automático Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, EUA). As sequências de nucleotídeos obtidas foram usadas para pesquisar uma correspondência no banco de dados GenBank do Centro Nacional de Informações sobre Biotecnologia dos EUA (NCBI). A análise filogenética foi realizada usando o programa MEGA 6 (Tamura et al., 2013).

A determinação da virulência foi realizada em frutos verdes inteiros de tomate de frutos grandes (variedade Dubrava) e tubérculos de batata (variedade Gala). Além disso, para simular danos a frutos e tubérculos danificados, usamos fatias dos mesmos frutos e tubérculos. Fatias de tubérculos foram colocadas em câmaras úmidas, que eram placas de Petri com papel de filtro úmido no fundo. Sobre o papel era colocada uma lâmina, sobre a qual, por sua vez, eram colocadas rodelas de tubérculos ou frutos. Tubérculos inteiros e frutas também foram colocados em recipientes com papel de filtro úmido no fundo. No centro da fatia (ou na superfície intacta do tubérculo ou fruto), um pedaço de ágar (5 × 5 mm) com hifas fúngicas foi colocado após 5 dias de cultivo em ágar mosto.

A avaliação da resistência de cepas fúngicas aos fungicidas foi realizada em condições de laboratório em meio nutriente ágar. Nós estudamos a suscetibilidade a drogas fungicidas Maxim, KS (ingrediente ativo fludioxonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoxistrobina 250 g / l), Scor, EC (difenoconazol 250 g / l) (catálogo estadual ..., 2020). A avaliação foi realizada em placas de Petri em meio ágar-mosto com adição dos fármacos estudados nas concentrações da substância ativa 0.1; 1; 10 ppm (mg / L) (para fludioxonil e difenoconazol), 1; dez; 10 ppm (para azoxistrobina) e em meio sem fungicida (controle). O fungicida foi adicionado ao meio derretido e resfriado a 100 ° C, após o que o meio foi vertido em placas de Petri. Um bloco de ágar com micélio fúngico foi colocado no centro de uma placa de Petri e cultivado a uma temperatura de 60 ° C no escuro. Após 24 dias de incubação, os diâmetros das colônias foram medidos em duas direções perpendiculares entre si; os resultados das medições para cada colônia foram calculados. Os experimentos foram realizados em triplicata. Com base nos resultados das análises, foi calculado o EC7, igual à concentração do fungicida, que reduziu pela metade a taxa de crescimento radial da colônia em relação ao controle fungicida.

Resultados e discussão

Em placas de Petri com ágar mosto, o fungo formou colônias com micélio floculento branco. O meio sob o micélio tornou-se marrom-avermelhado. Quando o meio seca, o fungo forma esporos de dois tipos em conidióforos simples e agregados em pequenos esporodóquios. Os macroconídios são alongados, cilíndricos, com um a três septos, comprimento médio de 27.2 µm com uma faixa de valores de 23.2 a 32.2 µm, largura - até 4.9 µm (Fig. 1). O comprimento médio dos microconídios é de 14.3 µm com uma faixa de valores de 10.3 a 18.1 µm, a largura é de até 4.0 µm. Todos os caracteres macro e micromorfológicos se enquadram na faixa de variação da espécie Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).

As sequências de regiões de DNA específicas da espécie (ITS, b-tubulina, TEF 1α) coincidiram completamente com as sequências das cepas de I. crassa que estudamos anteriormente (Chudinova et al., 2019, Tabela 1). Para estudar a prevalência de I. crassa em outras regiões e analisar o espectro de culturas afetadas, foram analisadas sequências de DNA análogas no banco de dados do GenBank (Tabela 1). A sobreposição foi de 86 a 100%. As sequências de todas as três regiões de DNA da cepa “batata” I. crassa eram idênticas às sequências das cepas isoladas do bulbo de lírio e raízes de narciso na Holanda e da raiz de ginseng no Canadá. Não encontramos outras cepas de I. crassa com três sequências semelhantes analisadas em bancos de dados abertos. No entanto, a análise das sequências de ITS e b-tubulina depositadas mostrou a presença de I. crassa em folhas de tulipa no Reino Unido. Fungos com sequência ITS semelhante foram identificados ao analisar a micobiota de raízes de álamo tremedor no Canadá e raízes de faia na Itália, e tubérculos de batata na Arábia Saudita (Tabela 1). Os resultados deste estudo mostram que I. crassa tem distribuição global e é capaz de infectar várias espécies de plantas.

Na determinação da patogenicidade em fatias de tomate e batata no 5º dia, o diâmetro da lesão atingiu 1.5 cm A cepa investigada não infectou o fruto do tomate inteiro e tubérculo de batata intacto. No entanto, as sépalas foram afetadas no tomate. Para excluir a possibilidade de contaminação, um isolado fúngico do micélio desenvolvido em uma fatia de tubérculo de batata foi isolado em uma cultura pura. Era completamente idêntico à linhagem parental. Aparentemente, I. crassa é um parasita de feridas.

O tratamento pré-plantio dos tubérculos de semente com fungicidas reduz o desenvolvimento de doenças nas plantas durante a estação de crescimento. Para a seleção de fungicidas eficazes, é importante avaliar quais deles são eficazes contra I. сrassa. O trabalho estudou substâncias ativas generalizadas de fungicidas - fludioxonil, azoxistrobina, difenoconazol. O fludioxonil está incluído em várias misturas usadas para tratar sementes e tubérculos de sementes antes do plantio. Fludioxonil (Maxim) também é usado para tratar tubérculos de sementes antes do armazenamento. O difenoconazol e a azoxistrobina também estão incluídos em uma série de preparações usadas para o processamento de sementes, bem como em preparações destinadas ao processamento de plantas vegetativas (catálogo estadual ..., 2020).

A taxa de crescimento de I. crassa foi estudada em meio (Fig. 2) com diferentes concentrações de substâncias ativas: fludioxonil (EC50 = 0.4 ppm), azoxistrobina (EC50 = 4 ppm) e difenoconazol (EC50 = 7.4 ppm) (Tabela 2). Essas preparações podem ser consideradas altamente eficazes contra I. crassa, uma vez que seu EC50 é significativamente inferior à concentração recomendada da preparação no fluido de trabalho usado para tratar tubérculos. De acordo com o Catálogo Estadual ... (2020), a concentração de fludioxonil no líquido para tratamento de tubérculos de batata é de 500 a 1000 ppm, azoxistrobina (no líquido para tratamento do fundo do sulco) - 3750-9375 ppm, difenoconazol (no líquido para tratamento de plantas vegetativas) - 187.5- 625 ppm.

Tabela 1. Similaridade de sequências de sequências específicas de espécies da cepa 18KSuPT2 e cepas de Ilyonectria crassa disponíveis no banco de dados Genbank

ND = não depositado

Tabela 2. Resistência de Ilyonectria crassa a fungicidas

Em nosso trabalho, cepas de I. crassa foram isoladas de tubérculos de batata nas regiões de Kostroma e Moscou (Chudinova et al., 2019). Uma alta proporção de cepas de fungos com sequências ITS idênticas a I. crassa foi revelada ao analisar a micobiota de tubérculos de batata na Arábia Saudita (Gashgari e Gherbawy, 2013). Aparentemente, I. crassa não é tão raro na batata como pode parecer. Nossos experimentos mostraram que o fungo pode infectar frutos de tomate danificados. Sabe-se da literatura que I. crassa é capaz de se desenvolver saprotroficamente no solo (Moll et al., 2016), além de afetar uma variedade de plantas, mesmo taxonomicamente distantes, como narcisos, lírios, ginseng, choupo e faia (Tabela 1). XNUMX). Aparentemente, muitas plantas silvestres e de jardim podem ser reservas de I. crassa. O exposto acima mostra que ao desenvolver medidas de proteção, é necessário levar em consideração a possibilidade de afetar os tubérculos de batata com esse fungo. As preparações amplamente difundidas para o tratamento de tubérculos de batata contendo fludioxonil, azoxistrobina e difenoconazol têm demonstrado alta eficácia fungicida contra I. crassa.

Este trabalho foi financiado pela Fundação Russa para Pesquisa Básica (Grant No. 20-016-00139).

O artigo foi publicado na revista "Plant Protection Bulletin", 2020, 103 (3)